熒光原位雜交分析系統(tǒng)可以同時(shí)使用多種不同熒光標(biāo)記的探針，對(duì)多個(gè)不同的核酸靶序列進(jìn)行檢測(cè)。例如，在同一個(gè)細(xì)胞樣本中，可以分別用不同顏色的熒光探針來檢測(cè)不同的染色體、基因或者染色體結(jié)構(gòu)變異情況等。這種多靶檢測(cè)的能力使得研究人員或臨床醫(yī)生能夠一次性獲取更多關(guān)于樣本遺傳學(xué)特征的信息，提高了檢測(cè)效率，也揭示了細(xì)胞內(nèi)核酸層面的復(fù)雜變化規(guī)律。
熒光原位雜交分析系統(tǒng)(FISH)的測(cè)定步驟：
1.樣本準(zhǔn)備
-載玻片處理：需清潔干凈，有的需進(jìn)行特殊處理，如1鹽酸酒精浸泡蓋玻片等。
-細(xì)胞或組織處理：根據(jù)樣本類型不同，處理方法各異。如遺傳病常用外周血、羊水等制備染色體；血液病用外周血或骨髓細(xì)胞；實(shí)體腫瘤可從多種組織、細(xì)胞或體液中獲取標(biāo)本。對(duì)組織學(xué)標(biāo)本，要及時(shí)固定、脫水、透明、浸蠟、切片等，石蠟切片厚度一般為3-5微米，貼于專用防脫載玻片上。
2.預(yù)處理
-脫蠟：烤好的組織切片需用二甲苯脫蠟，脫蠟不足會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，二甲苯需定期更換。
-酶消化：常用胃蛋白酶或蛋白酶K等對(duì)切片進(jìn)行酶消化，以增加探針與靶核酸結(jié)合機(jī)會(huì)，但要注意酶濃度、消化時(shí)間和孵育溫度，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞或消化不透徹。
-梯度乙醇脫水：將組織切片依次置于70、85、100乙醇中各2分鐘左右脫水，自然晾干。
3.探針制備與應(yīng)用
-探針配制：即用型探針可直接使用，非即用型探針需按說明書與雜交緩沖液配制，注意避免反復(fù)凍融，混勻時(shí)需輕柔。
-探針加樣：參照標(biāo)準(zhǔn)加樣量滴加到待雜交組織中央，使用合適蓋玻片，橡膠水泥密封四邊，注意避光，避免氣泡和封膠不嚴(yán)。
-變性及雜交：有甲酰胺變性雜交(手工操作)和雜交儀變性雜交(自動(dòng)操作)兩種方式，根據(jù)探針要求設(shè)定共變性雜交條件，如變性溫度72-95℃、時(shí)間3-5分鐘，雜交溫度37或42℃、時(shí)間16-18小時(shí)等。
4.雜交后清洗
-漂洗：用不同濃度的鹽溶液或含有去離子甲酰胺的溶液等進(jìn)行多次漂洗，去除未結(jié)合的探針，降低背景信號(hào)。
-復(fù)染：加入DAPI等復(fù)染劑，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，便于在熒光顯微鏡下觀察。
5.圖像采集與分析
-圖像采集：使用熒光顯微鏡或共聚焦熒光顯微鏡觀察，采集熒光信號(hào)圖像。
-數(shù)據(jù)分析：對(duì)采集到的圖像進(jìn)行分析，判斷目標(biāo)核酸的位置、數(shù)量、形態(tài)等，得出相應(yīng)結(jié)論。
關(guān)注微信